มหาวิทยาลัยมหิดล ศาลายา ตั้งอยู่บนถนนพุทธมณฑล สาย 4 ตำบลศาลายา อำเภอพุทธมณฑล จังหวัดนครปฐม ทางทิศตะวันตกของกรุงเทพฯ ระยะทางประมาณ 20 กิโลเมตร สามารถเดินทางมาได้หลายเส้นทาง ได้แก่

การเดินทางโดยรถยนต์

การเดินทางโดยรถประจำทาง รถทัวร์โดยสาร รถตู้

การเดินทางโดยรถไฟ (รถไฟสายใต้)

ขึ้นได้ที่สถานีธนบุรี (ใกล้ โรงพยาบาลศิริราช) หรือสถานีหัวลำโพง หรือสถานีนครปฐม โดยขบวนเที่ยวต่างๆ จะผ่านสถานีศาลายา ให้ลงที่สถานีศาลายาแล้ว นั่งรถรับจ้างเข้ามหาวิทยาลัยทางด้านหลัง หรือใช้บริการ รถเมล์เล็กมาทางด้านหน้ามหาวิทยาลัย

การเดินทางโดยรถโดยสารศาลายาลิงค์

ศาลายาลิงค์ (Salaya link) เป็นรถโดยสารจากศาลายา เชื่อมต่อกับจากสถานีรถไฟฟ้า (BTS) บางหว้า อัตราค่าโดยสาร 30 บาท ตลอดสาย (ให้เตรียมเงินพอดีหยอดตู้บนรถ ไม่มีทอน)
ออกจากมหาวิทยาลัยที่ชานชลาศาลายาลิงค์ วิทยาลัยดุริยางคศิลป์ เวลาออก 06.45 / 07.10 / 07.30 / 08.35 / 09.35 / 11.35 / 12.30 / 13.30 / 14.30 / 16.10 / 17.10 / 18.10 / 18.40
ออกจากสถานีรถไฟฟ้าบางหว้า ทางออกที่ 1-2 เดินไปประมาณ 20 เมตรถึงป้ายรถประจำทาง เวลาออก 06.00 / 06.30 / 07.00 / 08.00 / 09.00 / 11.00 / 12.00 / 13.00 / 14.00 / 15.30 / 16.30 / 17.30 / 18.00

การเดินทางภายในมหาวิทยาลัยมหิดล ศาลายา

มหาวิทยาลัยมหิดล ศาลายา ได้จัดรถรางให้บริการรับ-ส่งระหว่างหน่วยงานภายในมหาวิทยาลัย โดยไม่มีค่าใช้จ่ายในการใช้บริการ จำนวน 16 คัน แบ่งเป็น 4 สาย ได้แก่ สายที่ 1 (สีเขียว) สายที่ 2 (สีน้ำเงิน) สายที่ 3 (สีแดง) สายที่ 4 (ศูนย์การเรียนรู้มหิดล-สำนักงานอธิการบดี) และมีรถรางสายพิเศษ (บริการต้อนรับแขกมหาวิทยาลัยและใช้ในโอกาสพิเศษต่างๆ)